EN
فارسی
中国人
امروزهPCR یک تکنیک رایج در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی و تحقیقاتی است و كاربردهای نامحدودی در عرصه های مختلف زيست مولكولی دارد. از این تکنیک به‌عنوان روشی سریع ، دقیق و حساس برای تشخیص بیماری‌های عفونی، نمونه سلول غیر طبیعی یا تشخیص تغییرات ژنتیکی که می‌توانند باعث بیماری شوند و شناسایی مقادیر کمی از سلول‌های سرطانی استفاده می کنند.
در این مقاله و در مقالات بعدی مروری بر موضوعات زیر خواهیم داشت و تکنیک PCR را با جزئیات بیشتری بررسی می‌کنیم:
- PCR چیست؟
- اساس واکنش PCR چیست ؟
- مراحل PCR
- PCR چگونه انجام می شود؟
- كاربردهای PCR
- معایب و مزایای روش PCR
- انواع تکنیک ها و روش های PCR
- انواع مواد و اجزا مورد نیاز (Master Mix)در PCR
- تفاوت مستر میکس one-step و two-step
- انواع تجهیزات مورد نیاز
- آشنایی با پارامتر های موجود در PCR
- عوامل تاثیر گذار در تست PCR
- تفسیر نتایج در PCR
- اهمیت طراحی پرایمر و انتخابtarget gene در غربالگری و تشخیص عوامل عفونی و بیماری ها
- جایگاه PCR در تشخیص آزمایشگاهی
- معرفی کیت های موجود در بازار
- معرفی انواع دستگاه ها موجود در بازار
PCR چیست؟
PCR مخفف Polymerase Chain Reaction ( واکنش زنجیره ای پلیمراز ) است . امروزهPCR یک تکنیک رایج در آزمایشگاه های تشخییص پزشکی و تحقیقاتی است که کاربردهای زیادی دارد. از این تکنیک به‌عنوان روشی سریع ، دقیق و حساس برای تشخیص بیماری‌های عفونی، نمونه سلول غیر طبیعی یا تشخیص تغییرات ژنتیکی که می‌توانند باعث بیماری شوند و شناسایی مقادیر کمی از سلول‌های سرطانی استفاده می کنند.
PCR تکنیکی است که در آزمایشگاه برای ساخت میلیون‌ها نسخه از یک بخش خاص از DNA استفاده میشود. در سال 1971، Khorana و همكارانش روشی را برای همانند سازی يک ناحيه از DNA دو رشته ای با استفاده از دو پرايمر گزارش كردند كه در آن انتهاهای '3 به سمت يكديگر طراحی شده بود. هرچند استفاده از اين روش به صورت چرخه های تكراری در يک واكنش تكثيری، در ابتدا در سال 1983 توسط Kary Mullis در شركت Cetus توسعه یافت ، او در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را برای اختراع خود دریافت کرد.
اساس واکنش PCR چیست ؟
برای استفاده و تشخیص در آزمایش‌های مولکولی و ژنتیکی معمولاً مقادیر زیادی DNA لازم است،با استفاده از این تکنیک می توان در يک سيستم بافری ساده یک قطعه خاصی ازDNA الگو (تارگت) را با استفاده از پرایمر و آنزیم DNA پليمراز در لوله آزمایش به میزان زیادی تکثیر و جدا کرد.به اين جهت، پرايمرهای اليگونوكلئوتيدی اختصاصی طراحی می شوند كه بر اساس قوانين كلی جفت شدن بازها، به DNA الگو متصل می شوند و موجب تكثير آن قطعه خاص می شوند.
با استفاده از PCR می توان هزاران تا میلیون ها نسخه از یک بخش خاص از ژنوم (تارگت) را از مقدار بسیار کمی DNA تولید کرد. هیچ محدودیتی در انتخاب قطعه مورد نظر وجود ندارد و ممکن است حاوی تمام یا بخشی از ژن‌های رمزکننده یک پروتئین، RNA یا بخشی از یک بیومارکر یا حتی بخش کوچکی از یک پلازمید باشد.
مراحل PCR
سه مرحله اساسی وجود دارد که در تمام انواع PCR مشترک است ، در اين فرآيند ابتدا رشته های DNA الگو با استفاده از حرارت عمدتاً با دمای حدود 96-92 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه از هم جدا می شوند، حرارت باعث می شود كه پيوندهای هيدروژنی بين جفت بازهای رشته های DNA شكسته شوند (Denaturation)، سپس در دمای پایین تر حدود 55-45 درجه سانتیگراد پرايمرهای اليگونوكلئوتيدی توالی های مكمل خود را بر روی DNA الگو پيدا و به آن وصل می شوند (Annealing)، در نهايتDNA پليمراز مقاوم به حرارت با اضافه كردن دی اكسی نوكلئوتيدها در انتهای OH-'3 پرايمرها در دمای بهینه که معمولا حدود 72 درجه سانتیگراد است ، باعث ايجاد مولكول های جديد از روی هر دو رشته میشود(Extension). با توجه به اينكه مراحل در یک ترمو سایکلر خودکار که دما را تغییر می دهد به دفعات زياد در حدود 30-20 بار در مدت زمان کوتاهی تكرار می شود، تعداد نسخه های توالی DNA هدف به صورت تصاعدی طبق فرمول n2 (تعداد سیکل n=)افزايش می يابد.محصول تكثير شده بر اساس روش مورد استفاده با متد های خاص مورد ارزیابی قرار میگیرد.
كاربردهای PCR
PCR معمولاً به یک آزمایش تشخیصی سریع و دقیق برای علائم اولیه یک بیماری عفونی یا ژنتیکی اشاره دارد ،جهت تشخيص عفونت های ميكروبی، تكنيک های معمول در آزمايشگاه ها شامل كشت و شناسايی ارگانيسم و بررسی های سرولوژيكی نظير حضور آنتی بادی اختصاصی ضد باكتری در بيماران می باشد. تست های شناسايی معمولاَ وقت گير بوده و بررسی های ايمنولوژيكی نيز گاهی حساسيت لازم را ندارند و یا در مراحل اوليه بيماری قابل اندازه گيری نمی باشند.
امروزهPCR یک تکنیک رایج در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی و تحقیقاتی است و كاربردهای نامحدودی در عرصه های مختلف زيست مولكولی دارد. علت اصلی آن است كه DNA الگوی بكار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف مورد استفاده قرار داد. بطور كلی PCR به دو منظور اصلی بكار می رود:
1- تهيه نسخه های متعدد از يک ژن
برای تكثير يک قطعه از DNA نوتركيب و يا تهيه نسخه های زياد از يک ژن خاص جهت تعيين توالی آن می توان از PCR استفاده كرد.
2- بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در DNA
بدون شک، كاربرد دوم PCR مهمترين كاربرد آن و علت اصلی گسترش روز افزون آن در كليه شاخه های علوم زيستی می باشد. كاربردهای مختلف و وسيع PCR در اين زمينه شامل مراحل اولیه پردازش DNA برای تعیین توالی، برای تشخیص وجود یا عدم وجود یک ژن برای کمک به تعیین کمی و کیفی و تعیین ژنوتایپ عوامل عفونی ، هنگام تولید پروفایل های DNA در پزشکی قانونی از نمونه های کوچک DNA، به عنوان یک روش تشخیص سریع و زودهنگام برای تشخیص نقص ژنتیکی ، تعيين جنسيت جنين، تشخيص جهش ها و شناسایی مقادیر کمی از سلول‌های سرطانی یا سلول غیر طبیعی ، تشخیص ویروس ایدز در سلول های انسانی، کاربردهای جرم شناس و تحقیقات ژنتیکی و غیره را متحول کرده است…
معایب و مزایای روش PCR
استفاده از PCR برای نشان دادن حضور ژن های ويرولانس در باكتری ها بسيار معمول است و هرچند در جهت تشخيص سريع بكار می رود ولی موجب ريشه كنی روش های فنوتيپی و مرسوم در آزمايشگاه ها نمی شود. تنها حضور ژن در میکروارگانیسم نشان دهنده بيان آن نيست بلكه ميزان بيان ژن، فنوتيپ را مشخص می سازد كه آن نيز تحت کنترل شرایط كمپلكس محیطی و ساير ژن های باكتری است .
از PCR برای تشخيص سريع ميكروارگانيسم های بيماريزای خطرناک، ارگانیسم هایی كه به سختی در محيط های مصنوعی رشد می كنند و يا آنهايی كه اصلاً قابل كشت نمی باشند نیز استفاده می شود. مثلاَ Mycobacterium tuberculosis (عامل بيماری سل)که يک باكتری بسيار كند رشد است و رشد معمولی آن در آزمايشگاه حدود 20 روز طول می كشد. در این مورد برای تشخيص، نمونه های خلط بيماران باید هضم و علاوه بر کشت، بررسی ميكروسكوپی شوند که برای متصديان آزمايشگاه نیز خطرناک می باشد…..
