EN
فارسی
中国人
تکنیک PCR یک واکنش آنزیمی است بنابراین نسبت به مهارکننده‌ها بسیار حساس است.
PCR inhibitors یا همان مهارکننده‌های PCR، شامل تمام موادی است که تأثیر منفی بر انجام واکنش PCR دارند. مهارکننده‌های PCR نشان‌دهنده گروه متنوعی از مواد با خواص و مکانیسم‌های عمل متفاوت هستند. بنابراین مواد آلی و معدنی، که ممکن است محلول یا جامد باشند، می‌توانند به عنوان بازدارنده PCR ظاهر شوند.
یون‌های کلسیم نمونه‌ای برای مواد معدنی با اثرات بازدارنده بر روی PCR هستند. با این حال، بیشتر مهارکننده‌های شناخته شده ترکیبات آلی هستند به عنوان مثال: نمک‌های صفراوی، اوره، فنل، اتانول، پلی ساکاریدها، سدیم دودسیل سولفات، اسیدهای هیومیک، اسید تانیک، ملانین و همچنین پروتئین‌های مختلف مانند کلاژن، میوگلوبین، هموگلوبین، لاکتوفرین، ایمونوگلوبین G و پروتئینازها.
مهارکننده‌های PCR می‌توانند از نمونه منشا گرفته شوند یا ممکن است در طول پردازش نمونه یا استخراج اسید نوکلئیک وارد شوند و بر حساسیت سنجش تأثیر بگذارد یا حتی منجر به نتایج منفی کاذب شود. علاوه بر کلاس ماده، غلظت ترکیب برای اثر بازدارندگی آن مهم است.
شناسایی مداخله‌گرها یا مهارکننده‌های PCR
شناسایی مداخله‌گرها یا مهارکننده‌ها (inhibitors) در واکنش PCR می‌تواند یکی از دلایل مشاهده‌ی نتایج منفی کاذب باشد که در این پست به تعدادی از این مهارکننده‌ها اشاره شده است که با شناخت آن‌ها بتوانیم تا حد ممکن از وجود آن‌ها در واکنش جلوگیری کنیم.
• DNA، ممکن است به سطوح پلیمری نظیر بافت‌های جدا شده از دیواره عروق و یا لوله‌های واکنش، در طول استخراج یا در طول PCR جذب شوند و کارایی پردازش نمونه و استخراج اسید نوکلئیک ممکن است تحت تأثیر قرار گیرد.
• نوکلئازها ممکن است RNA یا DNA الگو را تجزیه کنند.
• فنل‌ها ممکن است تحت شرایط اکسیدکننده، RNA را به هم متصل کنند و در نتیجه جداسازی RNA را مختل گردد.
• وجود پلی ساکاریدها ممکن است ظرفیت RNA رسوب شده را کاهش دهد.
• در نمونه‌های خون، سرم یا پلاسما، موادی مانند IgG، هموگلوبین و لاکتوفرین به عنوان مهارکننده‌های PCR توصیف شده‌اند.
• داروهای ضد انعقاد، به عنوان مثال هپارین نیز ممکن است PCR را مهار کنند.
• هورمون‌ها یا مواد ضد ویروسی مانند آسیکلوویر نیز می‌توانند بر تقویت اثر بگذارند.
• مهمترین جزء در نمونه‌های ادرار اوره می‌باشد که ممکن است منجر به تخریب پلیمراز شود. با این حال، این اثر به غلظت اوره در نمونه بستگی دارد و با غلظت حدود ۵۰ میلی مول در لیتر شروع می‌شود و از آنجایی که دفع ادرار در انسان – بسته به رژیم غذایی و سن – در محدوده بین ۳۴۰ تا ۵۸۰ میلی مول اوره در روز است، غلظت‌های مهاری غیرعادی نیست.
حذف مداخله‌گرها در فرآیندPCR
• اثرات مهارکننده‌های PCR می‌تواند با انتخاب روش مناسب برای پردازش نمونه و استخراج اسید‌نوکلئیک، انتخاب یک DNA پلیمراز قوی و یا با استفاده از افزودنی‌های خاص کاهش یابد.
• در روش استخراج با گوانیدینیم تیوسیانات مهارکننده‌ها از نمونه حذف می‌شوند، درنتیجه این روش کارآمدتر از سایر روش‌های استخراج می‌باشد.
• استفاده از استخراج فنل-کلروفرم برای نمونه‌های لیپمیک باعث حذف لیپیدهای مهارکننده می‌شود.
• تیمار با کربن فعال برای از بین بردن نمک‌های بازدارنده مانند اورات کارآمد است که این روش در نمونه‌های ادرار کابرد دارد.
• گرم کردن نمونه یا تیمار با DNase
• کروماتوگرافی ستونی با استفاده از Sephacryl S-400، Sephadex G-200، Chelex، Sephadex یا Cetrimonium bromide می‌تواند برای حذف نمک‌ها، پروتئین‌های کوچک و همچنین پلی‌ساکاریدها از نمونه‌های مایع منی یا مدفوع استفاده شود.
• تکراراستخراج با استفاده از ستون‌های سیلیکا می‌تواند مهارکننده‌ها را حذف کند.
• از رزین‌های تعویض کاتیونی نیز برای حذف مهارکننده‌های PCR استفاده می‌شود.
• استفاده از دانه‌های سیلیس مغناطیسی برای جداسازی اسید‌نوکلئیک به طور موثری طیف وسیعی از مهارکننده‌های PCR را حذف می کند.
• روش‌های immune capture در حذف مهارکننده‌های PCR بسیار کارآمد هستند، زیرا می‌توان پاتوژن را بصورت اختصاصی از ماتریکس نمونه و مهارکننده‌ها جدا کرد.
• یک روش عمومی‌تر و پرکاربردتر، رقیق‌کردن نمونه یا اسید‌نوکلئیک استخراج‌شده است که منجر به رقیق‌شدن مهارکننده‌های PCR نیز می‌گردد. البته باید توجه داشت که رقیق‌سازی می‌تواند باعث کاهش حساسیت شود.
• یک استراتژی نیز افزودن یکسری مواد به مخلوط PCR است نظیر بتائین، آلبومین سرم گاوی، دی متیل سولفوکسید، فرمامید، گلیسرول، شوینده‌های غیریونی، پلی اتیلن گلیکول و شیرخشک. باید توجه داشت که BSA در برابر نمک‌های صفراوی، بیلی روبین، EDTA، کلرید سدیم، SDS، Triton X-100، کلسیم و کلاژن موثر نیست.